不同Wagner分级糖尿病足患者血清外泌体miR-3976的表达及机制

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2019.06.001

目的

观察不同Wagner分级的糖尿病患者血清及血清外泌体内microRNA-3976（miR-3976）的表达变化，并探讨其表达异常的可能机制。

方法

选取2018年3~6月中山大学孙逸仙纪念医院内分泌科28例糖尿病患者，通过逆转录-实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测血清及血清外泌体内miR-3976的表达水平，采用t检验比较不同Wagner分级糖尿病患者血清及血清外泌体miR-3976的表达差异。体外培养皮肤成纤维细胞和角质形成细胞，分别给予高糖、甘露醇及正常糖浓度培养，RT-qPCR法检测miR-3976的表达水平，采用单因素方差分析比较3种处理情况下细胞内miR-3976的表达差异。对miR-3976进行生物信息学分析。

结果

Wagner 3~4级糖尿病足患者与Wagner 0~2级患者相比，血清miR-3976表达水平显著升高（1.588±1.118 vs 1.068±0.108），差异具有统计学意义（t=3.256，P=0.0031），且血清外泌体中的miR-3976升高更显著（2.885±0.742 vs 1.156±0.220），差异具有统计学意义（t=2.435，P=0.0255）；高糖培养的成纤维细胞中miR-3976表达较正常糖及等渗甘露醇组显著升高（3.749±1.177 vs 1.000；3.749±1.177 vs 2.060±0.475），差异均具有统计学意义（q=6.497、3.992，P均<0.05），而HaCaT细胞在高糖、等渗甘露醇及正常糖培养情况下miR-3976表达差异无统计学意义（F=0.249，P=0.789）。miR-3976的靶基因KEGG信号通路分析结果显示靶基因在细胞间紧密连接信号通路上富集程度最高。

结论

Wagner 3~4级的糖尿病足患者血清中升高的miR-3976可能主要以外泌体的形式存在，且可能主要来源于伤口局部的成纤维细胞，并通过外泌体将表达增高的miR-3976传递至皮肤修复细胞，影响细胞紧密连接分子表达，从而抑制伤口愈合。

关键词: 糖尿病足, Wagner分级, 外泌体, miRNA, 生物信息学

Objective

To observe the changes of expression of microRNA-3976 (miR-3976) in serum and serum exosomes of patients with different Wagner grades of foot ulcers and explore the potential mechanism involved.

Methods

Peripheral blood serum samples of 28 patients with diabetic foot of different Wagner grades from Sun Yat-sen Memorial Hospital were used for RNA extraction or exosomal RNA extraction, and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to verify the difference of miR-3976 expression among patients in different groups. The t-test was performed to compare serum and serum exosomal miR-3976 expression levels among different groups of patients. Fibroblasts and HaCaT cells were cultured in medium with mannitol or high or normal level of glucose, and the level of miR-3976 expression in these cells was further detected and analyzed by one-way ANOVA. Bioinformatic analysis was used to explore the function of miR-3976.

Results

The expression of miR-3976 increased significantly in serum samples of patients with Wagner grades 3 and 4 disease compared with those with Wagner grades 0-2 (1.588±1.118 vs 1.068±0.108, t=3.256, P=0.0031). Serum exosomal miR-3976 increased more significantly than serum miR-3976 in patients with Wagner grades 3 and 4 (2.885±0.742 vs 1.156±0.220, t=2.435, P=0.0255). The level of miR-3976 expression increased significantly in fibroblasts treated with high sugar than in those treated with normal sugar (q=6.497, P<0.05) or mannitol (q=3.992, P<0.05), while there was no difference in HaCaT cells among different groups (F=0.249, P=0.789). Kytoencyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of target genes of miR-3976 indicated that the target genes are enriched most in the pathway of tight junction.

Conclusions

The upregulated expression of miRNA-3976 in patients with Wagner grades 3 and 4 diabetic foot may occur mainly in exosomes, which might mainly come from fibroblasts in the local wound. Exosomal miR-3976 may be transferred to cells involved in skin recovery and affect the expression of junctional molecules, thus inhibiting wound healing.

Key words: Diabetic foot, Wagner grade, Exosomes, MicroRNAs, Bioinformatics analysis

表1 Wagner分级0级与1~4级糖尿病患者临床资料比较

临床资料	Wagner 0级（7例）	Wagner 1~4级（21例）	Z值	P值
女性［例（%）］	1（14.29）	5（23.81）	-	1.000
年龄（岁，±s）	59.57±10.64	63.67±15.82	88.50	0.435
体质量指数（kg/m²，±s）	20.59±8.98	24.02±3.87	69.50	0.836
收缩压（mmHg，±s）	126.14±19.68	127.48±28.27	71.00	0.917
舒张压（mmHg，±s）	76.43±7.83	71.33±10.59	47.50	0.172
空腹血糖（mmol/L，±s）	6.03±2.17	7.60±3.42	92.00	0.348
糖化血红蛋白（%，±s）	8.57±3.23	8.50±2.53	81.00	0.717
血肌酐（μmol/L，±s）	127.71±101.42	143.33±96.94	80.00	0.756
血三酰甘油（mmol/L，±s）	3.14±4.89	1.27±0.71	56.50	0.376
血胆固醇（mmol/L，±s）	111.57±28.95	97.43±21.58	59.00	0.466
低密度脂蛋白胆固醇（mmol/L，±s）	308.43±144.58	356.48±137.30	62.50	0.568
高密度脂蛋白胆固醇（mmol/L，±s）	8.27±2.13	9.48±3.58	65.50	0.678
红细胞数（×10¹²/L，±s）	3.86±0.75	3.54±0.75	53.00	0.296
白细胞数（×10⁹/L，±s）	0.87±0.33	0.77±0.22	88.50	0.435
血小板数（×10⁹/L，±s）	2.79±1.38	2.3±0.53	88.50	0.435
血红蛋白（g/L，±s）	4.63±2.20	3.52±0.71	47.00	0.172

表1 Wagner分级0级与1~4级糖尿病患者临床资料比较

临床资料	Wagner 0级（7例）	Wagner 1~4级（21例）	Z值	P值
女性［例（%）］	1（14.29）	5（23.81）	-	1.000
年龄（岁，±s）	59.57±10.64	63.67±15.82	88.50	0.435
体质量指数（kg/m²，±s）	20.59±8.98	24.02±3.87	69.50	0.836
收缩压（mmHg，±s）	126.14±19.68	127.48±28.27	71.00	0.917
舒张压（mmHg，±s）	76.43±7.83	71.33±10.59	47.50	0.172
空腹血糖（mmol/L，±s）	6.03±2.17	7.60±3.42	92.00	0.348
糖化血红蛋白（%，±s）	8.57±3.23	8.50±2.53	81.00	0.717
血肌酐（μmol/L，±s）	127.71±101.42	143.33±96.94	80.00	0.756
血三酰甘油（mmol/L，±s）	3.14±4.89	1.27±0.71	56.50	0.376
血胆固醇（mmol/L，±s）	111.57±28.95	97.43±21.58	59.00	0.466
低密度脂蛋白胆固醇（mmol/L，±s）	308.43±144.58	356.48±137.30	62.50	0.568
高密度脂蛋白胆固醇（mmol/L，±s）	8.27±2.13	9.48±3.58	65.50	0.678
红细胞数（×10¹²/L，±s）	3.86±0.75	3.54±0.75	53.00	0.296
白细胞数（×10⁹/L，±s）	0.87±0.33	0.77±0.22	88.50	0.435
血小板数（×10⁹/L，±s）	2.79±1.38	2.3±0.53	88.50	0.435
血红蛋白（g/L，±s）	4.63±2.20	3.52±0.71	47.00	0.172

图1 外泌体鉴定结果

图2 miR-3976靶基因的GO-BP（基因功能注释-生物过程）富集差异倍数（fold enrichment）条形分布图

图3 miR-3976靶基因KEGG信号通路分布气泡图　气泡越大表示在该信号通路富集基因数目越多，气泡颜色越红表示P值越小

图4 miR-3976靶基因在细胞连接信号通路中的分布情况

1	Spinetti G, Fortunato O, Caporali A, et al. MicroRNA-15a and MicroRNA-16 Impair Human Circulating Proangiogenic Cell Functions and Are Increased in the Proangiogenic Cells and Serum of Patients With Critical Limb Ischemia [J]. Circ Res, 2013, 112(2): 335-346.
2	Zhang J, Li S, Li L, et al. Exosome and Exosomal MicroRNA: Trafficking, Sorting, and Function [J]. Genom Proteom Bioinf, 2015, 13(1): 17-24.
3	Zhou L, Lv T, Zhang Q, et al. The biology, function and clinical implications of exosomes in lung cancer [J]. Cancer Lett, 2017, 407: 84-92.
4	Colombo M, Raposo G, Thery C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles [J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2014, 30: 255-289.
5	Madhavan B, Yue S, Galli U, et al. Combined evaluation of a panel of protein and miRNA serum-exosome biomarkers for pancreatic cancer diagnosis increases sensitivity and specificity [J]. Int J Cancer, 2015, 136(11): 2616-2627.
6	Chamberlain JJ, Johnson EL, Leal S, et al. Cardiovascular Disease and Risk Management: Review of the American Diabetes Association Standards of Medical Care in Diabetes 2018 [J]. Ann Intern Med, 2018, 168(9): 640-650.
7	Warren Clayton J, Elasy TA. A Review of the Pathophysiology, Classification, and Treatment of Foot Ulcers in Diabetic Patients [J]. Clin Diabetes, 2009, 27(2): 52.
8	Rider MA, Hurwitz SN, Meckes DG. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles [J]. Sci Rep-UK, 2016, 6(1): 23978.
9	Witwer KW, Buza SEL, Bemis LT, et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research [J]. J Extracell Vesicles, 2013, 2(1): 20325-20360.
10	Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function [J]. Cell, 2004, 116(2): 281-297.
11	Poy MN, Eliasson L, Krutzfeldt J, et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion [J]. Nature, 2004, 432(7014): 226-230.
12	Esau C, Davis S, Murray SF, et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting [J]. Cell Metabolism, 2006, 3(2): 87-98.
13	Huang Y, Xie T, Cao Y, et al. Comparison of two classification systems in predicting the outcome of diabetic foot ulcers: the Wagner grade and the Saint Elian Wound score systems [J]. Wound Repair Regen, 2015, 23(3): 379-385.
14	王玉珍，刘志国，顾洪斌, 等. 糖尿病足溃疡预后的影响因素分析 [J]. 中国糖尿病杂志, 2010, 18(7): 507-511.
15	Volksdorf T, Heilmann J, Eming SA, et al. Tight Junction Proteins Claudin-1 and Occludin Are Important for Cutaneous Wound Healing [J]. Am J Pathol, 2017, 187(6): 1301-1312.
16	Ikari A, Takiguchi A, Atomi K, et al. Decrease in claudin-2 expression enhances cell migration in renal epithelial Madin-Darby canine kidney cells [J]. J Cell Physiol, 2011, 226(6): 1471-1478.
17	Yang C, Zhu P, Yan L, et al. Dynamic changes in matrix metalloproteinase 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 levels during wound healing in diabetic rats [J]. J Am Podiatr Med Assoc, 2009, 99(6): 489-496.
18	Xue S, Lei J, Yang C, et al. The Biological Behaviors of Rat Dermal Fibroblasts Can Be Inhibited by High Levels of MMP9 [J]. Experimental Diabetes Research, 2012, 2012: 1-7.

[1]	王睿, 邓俊, 施廷鑫, 张志兆, 王成方, 张毅, 齐晓伟. FAM91A1 可能是乳腺癌患者的独立预后因子[J/OL]. 中华乳腺病杂志(电子版), 2024, 18(05): 274-280.
[2]	刘政宏, 袁春銮. 乳腺癌患者血清外泌体中长链非编码RNA BC200的表达及临床意义[J/OL]. 中华乳腺病杂志(电子版), 2024, 18(04): 212-216.
[3]	王杰, 袁泉, 王玥琦, 乔佳君, 谭春丽, 夏仲元, 刘守尧. 溃疡油在糖尿病足溃疡治疗中的应用效果及安全性观察[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2024, 19(06): 480-484.
[4]	刘昌玲, 张金丽, 张志, 李孝建, 汤文彬, 胡逸萍, 陈宾, 谢晓娜. 负载人脂肪干细胞外泌体的甲基丙烯酰化明胶水凝胶对人皮肤成纤维细胞增殖和迁移的影响[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2024, 19(06): 517-525.
[5]	宋勤琴, 李双汝, 李林, 杜鹃, 刘继松. 间充质干细胞源性外泌体在改善病理性瘢痕中作用的研究进展[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2024, 19(06): 550-553.
[6]	姜珊, 李湘燕, 田硕涵, 温冰, 何睿, 齐心. 采用优化抗感染治疗模式改善糖尿病足感染预后的临床观察[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2024, 19(05): 398-403.
[7]	别瑶, 曹志斌, 辛静, 王健楠, 惠宗光. 应用基质血管成分细胞治疗糖尿病足溃疡的研究进展[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2024, 19(05): 453-456.
[8]	谢芬, 陈洁, 张媛媛, 刘茜, 胡芬, 李恭驰, 李炳辉, 金环. 移动健康管理模式在糖尿病足管理中的应用效果观察[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2024, 19(04): 335-340.
[9]	蔡定钦, 孙建国, 陈旭. 外泌体非编码RNAs与肺癌放射治疗的研究进展[J/OL]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2024, 17(04): 655-658.
[10]	袁雨涵, 杨盛力. 体液和组织蛋白质组学分析在肝癌早期分子诊断中的研究进展[J/OL]. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2024, 13(06): 883-888.
[11]	张蔚林, 王哲学, 白峻阁, 黄忠诚, 肖志刚. 利用TCGA数据库构建基于miRNA的结直肠癌列线图预后模型[J/OL]. 中华结直肠疾病电子杂志, 2024, 13(05): 381-388.
[12]	季鹏程, 鄂一民, 陆晨, 喻春钊. 循环外泌体相关生物标志物在结直肠癌诊断中的研究进展[J/OL]. 中华结直肠疾病电子杂志, 2024, 13(04): 265-273.
[13]	李京, 牛博, 刘晓蓓, 魏新雪, 黄荣. circ-SESN2 沉默靶向调控miRNA-23a-5p/ULK1 在神经细胞氧化应激损伤中的作用机制研究[J/OL]. 中华神经创伤外科电子杂志, 2024, 10(05): 263-272.
[14]	丁富贵, 吴泽涛, 董卫国. 家族性腺瘤性息肉病临床特征及生物信息学分析[J/OL]. 中华消化病与影像杂志(电子版), 2024, 14(06): 512-518.
[15]	曹磊, 邵轶普, 张志中, 王晨潮, 孙开文, 董阳, 闫东明, 李红伟, 杨波. 基于遗传基因的烟雾病与烟雾综合征生物信息学分析机制研究[J/OL]. 中华脑血管病杂志(电子版), 2024, 18(04): 350-356.

阅读次数

全文

摘要

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Serum exosomal miR-3976 in patients with diabetic foot of different Wagner grades: expression and possible mechanism involved

模态框（Modal）标题

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Serum exosomal miR-3976 in patients with diabetic foot of different Wagner grades: expression and possible mechanism involved