自噬及内质网应激在卡非佐米对MCF-7细胞的影响及作用机制

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2023.11.008

目的

探讨自噬及内质网应激在卡非佐米（Carfilzomib）对MCF-7细胞凋亡的影响及作用机制。

方法

体外培养MCF-7乳腺癌细胞，分为对照组及实验组，对照组进行传代培养，实验组卡非佐米（0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 nmol/L）作用0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h，自噬抑制剂3-MA（0.5、1、5、10、20、40、80、160 nmol/L）作用48 h，内质网应激抑制剂Salubrinal（2.5、5、10、20、40、80、160、320 umol/L）作用48 h，采用MTT比色法检测卡非佐米、3-MA、Salubrinal对MCF-7细胞活力的影响.确定实验组的各药物浓度后，实验分为对照组，卡非佐米3-MA组，卡非佐米+Salubrinal组，流式细胞仪检测细胞凋亡，荧光定量PCR检测mRNA表达水平，Western blot法检测蛋白表达水平。

结果

MTT检测结果显示卡非佐米随着浓度的升高和作用时间的延长细胞活性抑制作用增强，呈浓度依赖性与时间依赖性，当卡非佐米浓度为10 nmol/L作用48 h，抑制率为20.03±0.34**。3-MA，Salubrinal对MCF-7细胞增值抑制作用随着浓度增加作用增强。流式细胞检测结果提示与对照组相比，卡非佐米能够诱导MCF-7的凋亡，凋亡率为3.54%。协同3-MA和Salubrinal处理后，凋亡率增加至5.04%和6.95%。荧光定量PCR结果显示与卡非佐米组相比，卡非佐米+3-MA和卡非佐米+Salubrinal作用后，Grp-78和Caspase-12转录的mRNA均减少，Salubrinal减少作用更显著，而GADD153的表达在3-MA组和Salubrinal组差异并无统计学意义。与 mRNA 检测结果一致，3-MA组和Salubrinal组Grp-78蛋白的表达水平显著降低，Salubrinal对蛋白的降低作用更明显，GADD153在3-MA组和Salubrinal组表达差异无统计学意义。Caspase-12的表达则3-MA组低于Salubrinal组。

结论

卡非佐米抑制MCF-7细胞增值，同时诱导细胞自噬，且部分通过内质网应激通路，抑制自噬与内质网应激信号通路能够增强卡非佐米对MCF-7细胞的促凋亡作用。

关键词: 卡非佐米, MCF-7细胞, 凋亡, 自噬, 内质网

Objective

To investigate the effect of autophagy and endoplasmic reticulum (ER) stress on MCF-7 cells following carfilzomib treatment.

Methods

MCF-7 breast cancer cells cultured in vitro were divided into a control group and an experimental group. The experimental group was treated with carfilzomib at 10, 20, 40, 80, 160, and 320 nmol /L for 0, 3, 6, 12, 24, and 48 h, 3-methyladenine (3-MA, an autophagy inhibitor) at 0.5, 1, 5, 10, 20, 40, 80, and 160 nmol/L for 48 h, and salubrinal (an ER stress inhibitor) at 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, and 320 μmol/L for 48 h. MCF-7 cell viability was detected by MTT assay to determine the optimal concentration of the drugs used. Cells were then treated with carfilzomib alone, carfilzomib+3-MA, and carfilzomib+salubrinal. Cell apoptosis was detected by flow cytometry, mRNA level was detected by real-time PCR, and protein expression level was detected by Western blot.

Results

Treatment with carfilzomib inhibited the viability of MCF-7 cells, and the inhibitory rate was increased significantly with the increase in the concentration and treatment duration. When cells were treated with carfilzomib at 10 nmol/L for 48 h, the inhibition rate for MCF-7 cells was 20.03±0.34. 3-MA and salubrinal inhibited the viability of MCF-7 cells in a dose-dependent manner. Compared with untreated control cells, carfilzomib induced the apoptosis of MCF-7 cells, with an apoptosis rate of 3.54%. Co-treatment of carfilzomib with either 3-MA or salubrinal resulted in enhanced cell apoptosis (apoptosis rate: 5.04% and 6.95%, respectively) compared with cells treated with carfilzomib alone. Compared with the carfilzomib alone group, cotreatment with 3-MA and salubrinal significantly decreased the mRNA expression levels of Grp-78 and caspase-12, but had no signifciant impact on the mRNA expression level of GADD153. In addition, consistent with mRNA detection results, the expression level of GRP-78 in the carfilzomib+3-MA group and the carfilzomib+salubrinal group was significantly protein reduced. Although salubrinal had an more obvious effect on the protein reduction, there was no significant difference in the expression of GADD153 between the carfilzomib+3-MA group and the carfilzomib+salubrinal group. However, caspase-12 expression was decreased significantly in the carfilzomib+3-MA group compared with the carfilzomib+salubrinal group.

Conclusion

Carfilzomib inhibits MCF-7 cell proliferation and induces autophagy partially through the ER stress pathway. Inhibiting autophagy and ER stress can enhance the pro-apoptosis effect of carfilzomib on MCF-7 cells.

Key words: Carfilzomib, MCF-7 cell, Apoptosis, Autophagy, Endoplasmic reticulum

表1 Real Time PCR反应体系

试剂	体积（ul）
TB Green Premix Ex Tag II（Tli RNaseH Plus）（2x）	5
PCR Forward Primer（5 uM）	0.8
PCR Reverse Primer（5 uM）	0.8
ROX Reference Dye II（50 x）	0.2
CDNA 溶液	1
RNase Free Water	2.2
Total	10

表1 Real Time PCR反应体系

试剂	体积（ul）
TB Green Premix Ex Tag II（Tli RNaseH Plus）（2x）	5
PCR Forward Primer（5 uM）	0.8
PCR Reverse Primer（5 uM）	0.8
ROX Reference Dye II（50 x）	0.2
CDNA 溶液	1
RNase Free Water	2.2
Total	10

表2 引物序列

引物	序列
Grp-78-f	GCAGCAGGACATCAAGTTCT
Grp-78-r	CGCTGGTCAAAGCTTCTCC
caspase-12-f	AATCTGTGGGACCAAGCAAC
caspase-12-r	GAGCCTTTGTAACAGCATCA
GADD153-f	AATGCTTGCTCTGATAGGCG
GADD153-r	CTGGAATCTGGAGAGTGAGG

表2 引物序列

引物	序列
Grp-78-f	GCAGCAGGACATCAAGTTCT
Grp-78-r	CGCTGGTCAAAGCTTCTCC
caspase-12-f	AATCTGTGGGACCAAGCAAC
caspase-12-r	GAGCCTTTGTAACAGCATCA
GADD153-f	AATGCTTGCTCTGATAGGCG
GADD153-r	CTGGAATCTGGAGAGTGAGG

表3 卡非佐米对乳腺癌MCF-7细胞的抑制检测

药物	浓度（nmol/L）	OD值	抑制率（%）
Carfilzomib	0.625	0.974	15.15±0.72
	1.25	0.947	17.52±0.77^a
	2.5	0.937	18.36±0.61^a
	5	0.923	20.21±0.33^a
	10	0.921	20.03±0.34^a
	20	0.904	21.56±1.22^a
	40	0.805	30.52±3.37^a
	80	0.671	43.20±4.07^a
	160	0.459	64.23±3.19^a
	320	0.240	83.2±2.50^a
对照组	-	1.142	0

表3 卡非佐米对乳腺癌MCF-7细胞的抑制检测

药物	浓度（nmol/L）	OD值	抑制率（%）
Carfilzomib	0.625	0.974	15.15±0.72
	1.25	0.947	17.52±0.77^a
	2.5	0.937	18.36±0.61^a
	5	0.923	20.21±0.33^a
	10	0.921	20.03±0.34^a
	20	0.904	21.56±1.22^a
	40	0.805	30.52±3.37^a
	80	0.671	43.20±4.07^a
	160	0.459	64.23±3.19^a
	320	0.240	83.2±2.50^a
对照组	-	1.142	0

图1 卡非佐米对MCF-7细胞的增殖抑制作用。抑制作用6 h开始出现，8 h开始明显，作用48 h抑制效果最显著，并且随着浓度增加抑制作用增强，当卡非佐米浓度为10 nmol/L作用48 h，细胞增殖开始明显受抑制，抑制率为20.03±0.34^a，卡非佐米在48 h的IC20值约为10 nmol/L。

表4 3-MA对乳腺癌MCF-7细胞作用的MTT检测结果

药物	浓度（mmol/L）	OD值	抑制率（%）
3-MA	0.5	0.821	4.2±4.1^a
	1	0.804	6.1±1.2^a
	5	0.683	20.3±2.1^a
	10	0.461	46.2±4.5^a
	20	0.065	92.4±4.1^a
	40	0.018	97.9±1.5^a
	80	0.015	98.2±1.7^a
	160	0.024	97.2±2.4^a
对照组	-	0.857	0

表4 3-MA对乳腺癌MCF-7细胞作用的MTT检测结果

药物	浓度（mmol/L）	OD值	抑制率（%）
3-MA	0.5	0.821	4.2±4.1^a
	1	0.804	6.1±1.2^a
	5	0.683	20.3±2.1^a
	10	0.461	46.2±4.5^a
	20	0.065	92.4±4.1^a
	40	0.018	97.9±1.5^a
	80	0.015	98.2±1.7^a
	160	0.024	97.2±2.4^a
对照组	-	0.857	0

图2 3-MA作用下MCF-7乳腺癌细胞抑制率曲线.随着3-MA浓度变大，MCF-7细胞抑制率明显变大。（与对照组相比P<0.05）

表5 Salubrinal对乳腺癌MCF-7细胞作用的MTT检测结果

药物	浓度（umol/L）	OD值	抑制率（%）
Salubrinal	2.5	0.729	1.3±5.3^a
	5	0.707	4.3±6.1^a
	10	0.654	11.5±1.6^a
	20	0.546	26.1±1.7^a
	40	0.459	37.9±2.2^a
	80	0.112	84.8±3.8^a
	160	0.011	98.5±2.7^a
	320	0.010	98.7±4.7^a
对照组	-	0.739	0

表5 Salubrinal对乳腺癌MCF-7细胞作用的MTT检测结果

药物	浓度（umol/L）	OD值	抑制率（%）
Salubrinal	2.5	0.729	1.3±5.3^a
	5	0.707	4.3±6.1^a
	10	0.654	11.5±1.6^a
	20	0.546	26.1±1.7^a
	40	0.459	37.9±2.2^a
	80	0.112	84.8±3.8^a
	160	0.011	98.5±2.7^a
	320	0.010	98.7±4.7^a
对照组	-	0.739	0

图3 Salubrinal对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用曲线。随着Salubrinal浓度变大，MCF-7细胞抑制率明显变大（与对照组相比P<0.05）

图4 图a为各组作用12 h的OD值；图b为为各组作用24 h的OD值；图c为各组作用48 h的OD值

图5 流式细胞仪检测MCF-7细胞凋亡。图A为空白对照组;图B为卡非佐米组；图C为卡非佐米+3-MA组；图D为卡非佐米+Salubrinal组。

图6 3-MA和Salubrinal对卡非佐米诱导的MCF-7细胞自噬相关蛋白表达的影响。图a为自噬相关蛋白LC3蛋白电泳图；图b为自噬相关蛋白LC3-I蛋白灰度图；图c为自噬相关蛋白LC3-II蛋白灰度图

图7 3-MA和Salubrinal对卡非佐米诱导的MCF-7细胞凋亡相关蛋白表达的影响。图a为凋亡相关蛋白Bax、caspase-3及Bcl-2蛋白电泳图；图b为凋亡相关蛋白Bax蛋白灰度图；图c为凋亡相关蛋白caspase-3蛋白灰度图；图d为凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白灰度图

图8 3-MA和Salubrinal对内质网应激相关蛋白表达的影响。图a为内质网应激相关蛋白GRP-78，GADD153和，Caspase-12的蛋白电泳图；图b为内质网应激相关蛋白GRP-78蛋白灰度图；图c为内质网应激相关蛋白GADD153蛋白灰度图；图d为内质网应激相关蛋白Caspase-12蛋白灰度图

图9 3-MA和Salubrinal对Grp-78，GADD153与Caspase-12 mRNA表达的影响

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