不同状态下SAP2和STP1在白念珠菌伊曲康唑耐药中的作用

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2024.03.008

目的

探讨游离状态和生物膜状态下，毒力因子SAP2、转录因子STP1在临床分离白念珠菌伊曲康唑（ITR）耐药中的作用及其相互关系。

方法

实验菌株为临床分离伊曲康唑耐药白念珠菌菌株和敏感菌株各10株。首先，采用PCR方法对游离状态下临床分离白念珠菌伊曲康唑耐药和敏感菌株的SAP2、STP1进行测序，分析基因突变与耐药的关系；之后，利用96孔板构建白念珠菌生物膜；采用RT-PCR方法检测游离状态和生物膜状态下白念珠菌SAP2、STP1、STP1Δ/Δ的mRNA表达水平，比较分析不同状态下SAP2、STP1、STP1Δ/Δ的表达是否具有差异和相关性；进一步通过结晶紫染色法和激光共聚焦显微镜观察白念珠菌生物膜在各时间点的生长形态以及SAP2、STP1、STP1Δ/Δ对其形成能力的影响。

结果

SAP2测序显示无错义突变，存在3个同义突变（T276A、G543A和A675C）；STP1基因测序发现两个错义突变N394S和D71I，以及2个同义突变C453T、A799G，其中N394S在全部耐药和敏感菌株中都存在，而D71I仅存在于两株敏感菌株中。与敏感菌株相比，白念珠菌耐药菌株和STP1基因缺陷菌株（STP1Δ/Δ）的生物膜形成能力更强；耐药菌株在游离状态和生物膜状态下SAP2和STP1的表达均上调（P<0.05），并且与游离状态相比，耐药菌株和敏感菌株在生物膜状态下二者的表达量均显著升高（P<0.05）。而无论在何种状态下，SAP2和STP1的mRNA表达水平均呈显著正相关。此外，与标准菌株ATCC11006相比，STP1基因缺陷菌株（STP1Δ/Δ）中的SAP2表达在两种状态下也显著上调，差异具有统计学意义（P<0.05）。

结论

生物膜的形成可以使白念珠菌伊曲康唑耐药性增加，但SAP2、STP1基因突变可能与其耐药性无关；游离状态下，SAP2的高表达与白念珠菌ITR的耐药性有关，而无论在游离状态还是生物膜状态下，白念珠菌对ITR的耐药性增加均与STP1有关。此外，STP1对SAP2是具有调控作用的，其机制亟待研究。

关键词: 白念珠菌, SAP2, STP1, 伊曲康唑耐药

Objective

To investigate the role and relationship of virulence factor SAP2 and transcription factor STP1 in itraconazole (ITR) resistance of Candida albicans in free state and biofilm state.

Methods

The experimental strains were 10 itraconazole-resistant Candida albicans and 10 sensitive strains. Firstly, the SAP2 and STP1 of itraconazole-resistant and sensitive strains of Candida albicans isolated in free state were sequenced by PCR method, and the relationship between gene mutation and drug resistance was analyzed. Then, the biofilm of Candida albicans was constructed by 96-well plate. The mRNA expression levels of SAP2, STP1 and STP1Δ/Δ of Candida albicans in free state and biofilm state were detected by RT-PCR method, and the differences and correlation of SAP2, STP1 and STP1Δ/Δ expression in different states were compared and analyzed. The growth morphology of Candida albicans biofilm at different time points and the effects of SAP2, STP1 and STP1Δ/Δ on its formation ability were observed by crystal violet staining and laser confocal microscope.

Results

SAP2 sequencing showed that there were no missense mutations with three synonymous mutations (T276A, G543A and A675C), two missense mutations N394S (20) and D71I (2) and two synonymous mutations C453T (4) and A799G (1) were found in STP1 gene sequencing, among which N394S existed in all drug resistant and sensitive strains, while D71I only existed in two sensitive strains. Compared with sensitive strains, Candida albicans resistant strains and STP1 gene deficient strains (STP1Δ/Δ) had stronger biofilm forming ability, and the expressions of SAP2 and STP1 were up-regulated in free state and biofilm state, and the expression levels of SAP2 and STP1 in biofilm state were significantly higher in resistant and sensitive strains than in free state. However, there was a significant positive correlation between the mRNA expression levels of SAP2 and STP1 under any condition. In addition, compared with the standard strain ATCC11006, the expression of SAP2 in the STP1 gene deficient strain (STP1Δ/Δ) was also significantly up-regulated under the two states, and the difference was statistically significant.

Conclusion

The formation of biofilm can increase the itraconazole resistance of Candida albicans, but the mutations of SAP2 and STP1 genes may not be related to the drug resistance of Candida albicans. In free state, the high expression of SAP2 is related to the drug resistance of Candida albicans ITR, while in both free state and biofilm state, the increase of ITR resistance of Candida albicans is related to STP1. In addition, STP1 can regulate and control SAP2, and its mechanism needs to be studied urgently.

Key words: Candida albicans, SAP2, STP1, Itraconazole resistant

表1 实验用主要试剂

试剂	来源
甲醇	天津市福晨化学试剂厂
PBS缓冲液	北京索莱宝科技有限公司
冰醋酸	天津市北辰方正试剂厂
Calcoflour荧光增白剂	西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司
结晶紫染液	天津市北辰方正试剂厂
Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒	上海生工生物工程股份有限公司
2×SanTaq PCR Mix 预混液（含蓝染料）	上海生工生物工程股份有限公司
柱式酵母总RNA抽提纯化试剂盒	上海生工生物工程股份有限公司
MonScript^TM 5x RTIII All-in-One Mix	莫纳生物科技有限公司
MonScript^TM dsDNase	莫纳生物科技有限公司
伊曲康唑（ITR）、氟康唑（FCA）、伏立康唑（VRC）药粉	北京索莱宝生物科技有限公司
RPMI1640干粉培养基	北京赛普锐斯科技有限公司

表1 实验用主要试剂

试剂	来源
甲醇	天津市福晨化学试剂厂
PBS缓冲液	北京索莱宝科技有限公司
冰醋酸	天津市北辰方正试剂厂
Calcoflour荧光增白剂	西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司
结晶紫染液	天津市北辰方正试剂厂
Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒	上海生工生物工程股份有限公司
2×SanTaq PCR Mix 预混液（含蓝染料）	上海生工生物工程股份有限公司
柱式酵母总RNA抽提纯化试剂盒	上海生工生物工程股份有限公司
MonScript^TM 5x RTIII All-in-One Mix	莫纳生物科技有限公司
MonScript^TM dsDNase	莫纳生物科技有限公司
伊曲康唑（ITR）、氟康唑（FCA）、伏立康唑（VRC）药粉	北京索莱宝生物科技有限公司
RPMI1640干粉培养基	北京赛普锐斯科技有限公司

表2 实验用主要仪器设备

仪器	型号	公司
涡旋振荡混匀器	MixMate	德国Eppendorf公司
PCR仪	Mastercycel nexus X1型	德国艾本德股份公司
酶标仪	MK3型	热力（上海）仪器有限公司
电子式比浊仪	ATB1525	法国生物梅里埃股份有限公司
倒置显微镜	奥林巴斯 IX51	上海赖氏电子科技有限公司
恒温生化培养箱	SPX-250B-Z	博讯实业医疗设备厂
激光共聚焦显微镜	TCS SP8 X	德国Leica公司
实时荧光定量PCR仪	LightCycler96	上海罗氏诊断产品有限公司
96孔细胞培养板		北京江晨源远生物科技有限公司
6孔细胞培养板		上海生工生物工程股份有限公司

表2 实验用主要仪器设备

仪器	型号	公司
涡旋振荡混匀器	MixMate	德国Eppendorf公司
PCR仪	Mastercycel nexus X1型	德国艾本德股份公司
酶标仪	MK3型	热力（上海）仪器有限公司
电子式比浊仪	ATB1525	法国生物梅里埃股份有限公司
倒置显微镜	奥林巴斯 IX51	上海赖氏电子科技有限公司
恒温生化培养箱	SPX-250B-Z	博讯实业医疗设备厂
激光共聚焦显微镜	TCS SP8 X	德国Leica公司
实时荧光定量PCR仪	LightCycler96	上海罗氏诊断产品有限公司
96孔细胞培养板		北京江晨源远生物科技有限公司
6孔细胞培养板		上海生工生物工程股份有限公司

表3 体外抗真菌药物敏感性试验参考范围

抗真菌药物	S	SDD	R
FCA	≤2 μg/ml	4 μg/ml	≥8 μg/ml
VRC	≤1 μg/ml	2 μg/ml	≥4 μg/ml
ITR	≤0.125 μg/ml	0.25~0.5 μg/ml	≥1 μg/ml

表3 体外抗真菌药物敏感性试验参考范围

抗真菌药物	S	SDD	R
FCA	≤2 μg/ml	4 μg/ml	≥8 μg/ml
VRC	≤1 μg/ml	2 μg/ml	≥4 μg/ml
ITR	≤0.125 μg/ml	0.25~0.5 μg/ml	≥1 μg/ml

表4 生物膜形成能力判读标准

OD值	意义
OD_{490 nm}<0.03	无生物膜形成能力
0.03≤OD_{490 nm}<0.08	生物膜形成能力弱
0.08≤OD_{490 nm}<0.16	生物膜形成能力一般
OD_{490 nm}>0.16	生物膜形成能力强

表4 生物膜形成能力判读标准

OD值	意义
OD_{490 nm}<0.03	无生物膜形成能力
0.03≤OD_{490 nm}<0.08	生物膜形成能力弱
0.08≤OD_{490 nm}<0.16	生物膜形成能力一般
OD_{490 nm}>0.16	生物膜形成能力强

表5 聚合酶链式反应和实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）的所有引物序列

反应	引物名称	序列（5’~3’）
PCR	SAP2	F：ATG TTT TTA AAG AAT ATT TTC ATT GCT CTT GCT ATT G
	SAP2	R：TTA GGT CAA GGC AGA AAT ACT GGA AG
	STP1	F：ATGTTGATACTTTCCATAGGTTTAATCC
	STP1	R：TTAATCTAGTAATAGATTGCTTACATTCTGTT
RT-PCR	ACT1	F：TAG GTT TGG AAG CTG CTG GT
	ACT1	R：ACG TTC AGC AAT ACC TGG CA
	SAP2	F：ACC AAT GAA GCC GGT GGT AG
	SAP2	R：TTA TTT GTC CCG TGG CAG CA
	STP1	F：CCACCGCCATTCCACCAACAC
	STP1	R；AGACTCGACATCATCTGAGGAGACC

表5 聚合酶链式反应和实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）的所有引物序列

反应	引物名称	序列（5’~3’）
PCR	SAP2	F：ATG TTT TTA AAG AAT ATT TTC ATT GCT CTT GCT ATT G
	SAP2	R：TTA GGT CAA GGC AGA AAT ACT GGA AG
	STP1	F：ATGTTGATACTTTCCATAGGTTTAATCC
	STP1	R：TTAATCTAGTAATAGATTGCTTACATTCTGTT
RT-PCR	ACT1	F：TAG GTT TGG AAG CTG CTG GT
	ACT1	R：ACG TTC AGC AAT ACC TGG CA
	SAP2	F：ACC AAT GAA GCC GGT GGT AG
	SAP2	R：TTA TTT GTC CCG TGG CAG CA
	STP1	F：CCACCGCCATTCCACCAACAC
	STP1	R；AGACTCGACATCATCTGAGGAGACC

表6 菌株体外药敏试验结果（单位：μg/ml）

菌株名称	MIC₅₀（ITR）	MIC₅₀（FCA）	MIC₅₀（VRC）
17	16（R）	1（S）	0.013（S）
40	16（R）	0.25（S）	0.313（S）
54	8（R）	0.125（S）	0.0313（S）
58	16（R）	2（S）	0.313（S）
67	16（R）	0.25（S）	0.313（S）
68	8（R）	0.25（S）	0.313（S）
96	16（R）	0.25（S）	0.125（S）
105	16（R）	0.5（S）	0.313（S）
106	16（R）	2（S）	0.125（S）
188	16（R）	0.5（S）	0.313（S）
3	0.0625（S）	1（S）	0.250（S）
4	0.0625（S）	0.25（S）	0.313（S）
26	0.0625（S）	0.25（S）	0.313（S）
34	0.125（S）	0.5（S）	0.0313（S）
87	0.0313（S）	0.125（S）	0.0313（S）
95	0.0313（S）	1（S）	0.0313（S）
150	0.0313（S）	1（S）	0.0313（S）
157	0.0625（S）	0.5（S）	0.0313（S）
174	0.0625（S）	0.500（S）	0.0313（S）
176	0.125（S）	1（S）	0.0625（S）
ATCC11066	0.0313（S）	0.5（S）	0.0313（S）
STP1Δ/Δ	8（R）	46（R）	16（R）

表6 菌株体外药敏试验结果（单位：μg/ml）

菌株名称	MIC₅₀（ITR）	MIC₅₀（FCA）	MIC₅₀（VRC）
17	16（R）	1（S）	0.013（S）
40	16（R）	0.25（S）	0.313（S）
54	8（R）	0.125（S）	0.0313（S）
58	16（R）	2（S）	0.313（S）
67	16（R）	0.25（S）	0.313（S）
68	8（R）	0.25（S）	0.313（S）
96	16（R）	0.25（S）	0.125（S）
105	16（R）	0.5（S）	0.313（S）
106	16（R）	2（S）	0.125（S）
188	16（R）	0.5（S）	0.313（S）
3	0.0625（S）	1（S）	0.250（S）
4	0.0625（S）	0.25（S）	0.313（S）
26	0.0625（S）	0.25（S）	0.313（S）
34	0.125（S）	0.5（S）	0.0313（S）
87	0.0313（S）	0.125（S）	0.0313（S）
95	0.0313（S）	1（S）	0.0313（S）
150	0.0313（S）	1（S）	0.0313（S）
157	0.0625（S）	0.5（S）	0.0313（S）
174	0.0625（S）	0.500（S）	0.0313（S）
176	0.125（S）	1（S）	0.0625（S）
ATCC11066	0.0313（S）	0.5（S）	0.0313（S）
STP1Δ/Δ	8（R）	46（R）	16（R）

表7 C. albicans SAP2基因中发生碱基突变和氨基酸置换

菌株号	ITR药敏	碱基突变位点	氨基酸置换
17	R	G543A	无
40	R	G543A	无
54	R	T276A/G543A	无/无
58	R	T276A/A675C	无/无
67	R	G543A	无
68	R	T276A/G543A	无
96	R	G543A	无
105	R	G543A	无
106	R	G543A	无
188	R	T276A/G543A	无/无
3	S	无	无
4	S	无	无
26	S	A675C	无
34	S	A675C	无
87	S	T276A/A675C	无/无
95	S	G543A	无
150	S	A675C	无
157	S	G543A	无
174	S	G543A	无
176	S	T276A/A675C	无/无

表7 C. albicans SAP2基因中发生碱基突变和氨基酸置换

菌株号	ITR药敏	碱基突变位点	氨基酸置换
17	R	G543A	无
40	R	G543A	无
54	R	T276A/G543A	无/无
58	R	T276A/A675C	无/无
67	R	G543A	无
68	R	T276A/G543A	无
96	R	G543A	无
105	R	G543A	无
106	R	G543A	无
188	R	T276A/G543A	无/无
3	S	无	无
4	S	无	无
26	S	A675C	无
34	S	A675C	无
87	S	T276A/A675C	无/无
95	S	G543A	无
150	S	A675C	无
157	S	G543A	无
174	S	G543A	无
176	S	T276A/A675C	无/无

表8 C. albicans STP1基因中发生碱基突变和氨基酸置换

菌株号	ITR药敏	碱基突变位点	氨基酸置换
17	R	A1181Ga	N394S
40	R	A1181Ga	N394S
54	R	C453T/A1181Ga	无/N394S
58	R	A1181Ga	N394S
67	R	A1181Ga	N394S
96	R	C453T/A1181Ga	无/N394S
105	R	A1181Ga	N394S
106	R	C453T/A799G/A1181Ga	无/无/N394S
188	R	A1181Ga	N394S
3	S	C909Tb/A1181Ga	D71I/N394S
4	S	C909Tb/A1181Ga	D71I/N394S
26	S	A1181Ga	N394S
34	S	A1181Ga	N394S
87	S	A1181Ga	N394S
95	S	C453T/A1181Ga	无/N394S
150	S	A1181Ga	N394S
157	S	A1181Ga	N394S
174	S	A1181Ga	N394S
176	S	A1181Ga	N394S

表8 C. albicans STP1基因中发生碱基突变和氨基酸置换

菌株号	ITR药敏	碱基突变位点	氨基酸置换
17	R	A1181Ga	N394S
40	R	A1181Ga	N394S
54	R	C453T/A1181Ga	无/N394S
58	R	A1181Ga	N394S
67	R	A1181Ga	N394S
96	R	C453T/A1181Ga	无/N394S
105	R	A1181Ga	N394S
106	R	C453T/A799G/A1181Ga	无/无/N394S
188	R	A1181Ga	N394S
3	S	C909Tb/A1181Ga	D71I/N394S
4	S	C909Tb/A1181Ga	D71I/N394S
26	S	A1181Ga	N394S
34	S	A1181Ga	N394S
87	S	A1181Ga	N394S
95	S	C453T/A1181Ga	无/N394S
150	S	A1181Ga	N394S
157	S	A1181Ga	N394S
174	S	A1181Ga	N394S
176	S	A1181Ga	N394S

图1 倒置显微镜下（20×10倍）观察不同时间点白念珠菌生物膜生长情况。图a为结晶紫染色观察耐药菌株生物膜1 h形态特点，图b为结晶紫染色观察敏感菌株生物膜1 h形态特点，图c为结晶紫染色观察耐药菌株生物膜12 h形态特点，图d为结晶紫染色观察敏感菌株生物膜12 h形态特点，图e为结晶紫染色观察耐药菌株生物膜24 h形态特点，图f为结晶紫染色观察敏感菌株生物膜24 h形态特点，图g为结晶紫染色观察耐药菌株生物膜48 h形态特点，图h为结晶紫染色观察敏感菌株生物膜48 h形态特点

图2 激光共聚焦显微镜下（20×10倍）观察白念珠菌在1 h、12 h、24 h和48 h的生物膜生长情况。图A组为激光共聚焦观察生物膜1 h形态特点；图B组激光共聚焦观察生物膜12 h形态特点；图C组为激光共聚焦观察生物膜24 h形态特点；图D组为激光共聚焦观察生物膜48 h形态特点，a为标准菌株；b为耐药菌株；c为敏感菌株；d为STP1Δ/Δ菌株

表9 生物膜形成能力结果判读

菌株号	结果
3、4、26、95、150、174、176	生物膜形成能力弱
SC、STP1Δ/Δ、17、34、54、58、67、68、96、105、106、188、34、87、157	生物膜形成能力一般

表9 生物膜形成能力结果判读

菌株号	结果
3、4、26、95、150、174、176	生物膜形成能力弱
SC、STP1Δ/Δ、17、34、54、58、67、68、96、105、106、188、34、87、157	生物膜形成能力一般

图3 标准菌株与STP1Δ/Δ菌株生物膜形成能。*P<0.05

图4 耐药菌株与敏感菌株生物膜形成能力。***P<0.001

图5 游离状态下敏感与耐药菌株组SAP2与STP1表达水平。*P<0.05

图6 生物膜状态下敏感与耐药菌株组SAP2与STP1表达水平。ns P>0.05，**P<0.01

图7 不同状态下临床分离白念珠菌SAP2表达水平（左为耐药组，右为敏感组）。***P<0.001

图8 不同状态下临床分离白念珠菌STP1表达水平（左为耐药组，右为敏感组）。***P<0.001，**P<0.01

图9 不同状态下临床分离白念珠菌SAP2与STP1表达水平（耐药组和敏感组共同对比，即N=20）。***P<0.001

表10 临床分离白念珠菌在游离和生物膜状态下SAP2和STP1的相关性

状态	基因	相关系数（r）	P值
游离状态	SAP2	0.511	0.021
游离状态	STP1	0.511	0.021
生物膜状态	SAP2	0.834	<0.001
生物膜状态	STP1	0.834	<0.001

表10 临床分离白念珠菌在游离和生物膜状态下SAP2和STP1的相关性

状态	基因	相关系数（r）	P值
游离状态	SAP2	0.511	0.021
游离状态	STP1	0.511	0.021
生物膜状态	SAP2	0.834	<0.001
生物膜状态	STP1	0.834	<0.001

图10 图a为游离状态下ATCC11006和STP1Δ/Δ菌株的SAP2的表达水平；图b为生物膜状态下ATCC11006和STP1Δ/Δ菌株的SAP2的表达水平；图c为不同状态下STP1Δ/Δ菌株的SAP2表达水平。*P<0.05

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Study on the effect of SAP2 and STP1 in Itraconazole resistance of Candida albicans under different states

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