地尔硫䓬对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤影响的研究

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2019.11.012

目的

探讨地尔硫䓬对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其机制。

方法

33只大鼠随机分为3组：正常对照组（N组）、缺血再灌注组（I-R组）、地尔硫䓬＋缺血再灌注组（D/I-R组）。N组持续灌流K-H液150 min；I-R组K-H液稳定灌流30 min后，结扎前降支30 min，继以K-H液再灌注90 min；D/I-R组给予地尔硫䓬（5 μmo/L）再灌注15 min，继以K-H液再灌流75 min。记录并分析各组大鼠左心室发展压、左心室内压力最大上升/下降速率（±dp/dtmax）、再灌注心律失常评分、心肌梗死面积以及各组左心室心尖组织的线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）、Bcl-2以及Bax的mRNA基因与蛋白表达水平。

结果

（1）左心室发展压D/I-R组再灌注30 min与45 min比I-R组压力明显升高［（92.68±5.09）mmHg vs（75.77±5.33）mmHg；（90.39±4.29）mmHg vs（72.34±7.49）mmHg；1 mmHg=0.133 kPa］，差异均具有统计学意义（F=72.81、51.92，P均=0.001）。（2）±dp/dtmax D/I-R组再灌注30 min与45 min时均比I-R组升高［＋dp/dtmax：（2885.45±286.47）mmHg vs （2063.64±105.57）mmHg；（2712.73±236.52）mmHg vs（2053.64±92.33）mmHg；-dp/dtmax：（2214.55±104.63）mmHg vs （1710.91±217.97）mmHg；（2119.09±84.43）mmHg vs（1544.55±207.72）mmHg］，差异均具有统计学意义（F=64.22、70.55、69.77、54.64，P均=0.001）。（3）N组仅有室性期前收缩的发生，未发生心室颤动、室性心动过速；D/I-R组出现室性期前收缩的个数较N组增加，差异具有统计学意义（P=0.001）；I-R组室性心动过速发生率高于D/I-R组，心室颤动时程与室性心动过速时程均较D/I-R组增加，差异具有统计学意义（P=0.013、0.049、0.001）；再灌注心律失常评分I-R组评分［5（3，6），57.36］高于D/I-R组［3（1，4），34.77］，差异具有统计学意义（P=0.001）。（4）心肌梗死面积I-R组高于D/I-R组［（55.51±1.43）% vs （17.01±1.13）%］，差异具有统计学意义（P<0.01）。（5）I-R组线粒体ALDH2表达明显减少。D/I-R组线粒体ALDH2表达与I-R组比较减少，但差异无统计学意义（P=0.11），Bcl-2、Bax的表达均增加，D/I-R组Bcl-2/Bax的比值较I-R组增大（0.44 vs 0.22），差异具有统计学意义（P=0.001）。

结论

地尔硫䓬处理后能够减少缺血再灌注损伤。其保护作用机制之一可能是通过上调Bcl-2下调Bax的基因和蛋白表达，减少心肌细胞的凋亡，但其并不是通过上调线粒体ALDH2的基因与蛋白来实现。

关键词: 缺血，再灌注损伤, 地尔硫䓬, 线粒体, 乙醛脱氢酶2

Objective

To investigate the effects of diltiazem on myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI) and the underlying mechanisms.

Methods

Wistar rats were randomly divided into three groups: normal group (N group), ischemia-reperfusion group (I-R group), diltiazem+ ischemia-reperfusion group (D/I-R group). The isolated rat hearts in different groups were given different perfusion treatments: The N group was given continuous perfusion of K-H liquid for 150 min; the I-R group was given stable perfusion of K-H liquid for 30 min followed by ligating the left anterior descending coronary artery for 30 min, and K-H liquid reperfusion for 90 min; the D/I-R group underwent reperfusion with diltiazem (5 μmo/L) for 15 min and reperfusion with K-H liquid for 75 min. Left ventricular cardiac function (LVDP), maximal rise/fall rate of left ventricular pressure (±dp/dtmax), reperfusion arrhythmia (RA) score, calculated myocardial infarct (MI) size, and ALDH2, Bcl-2, and BAX expression in the left ventricular apex were recorded in each group.

Results

The LVDP at 30 min and 45 min in the D/I-R group was significantly higher than that of the I-R group, respectively [(92.68±5.09) mmHg vs (75.77±5.33) mmHg, F=72.81, P=0.001; (90.39±4.29) mmHg vs (72.34±7.49) mmHg, F=51.92, P=0.001]. The ±dp/dtmax at 30 min and 45 min in the D/I-R group were significantly higher than that of the I-R group, respectively [+ dp/dtmax: (2885.45±286.47) mmHg vs (2063.64±105.57) mmHg, F=64.22, P=0.001 and (2712.73±236.52) mmHg vs (2053.64±92.33) mmHg, F=70.55, P=0.001; -dp/dtmax: (2214.55±104.63) mmHg vs (1710.91±217.97) mmHg, F=69.77, P=0.001 and (2119.09±84.43) mmHg vs (1544.55±207.72) mmHg, F=54.64, P=0.001, respectively]. The number of ventricular pre-contractions in the I-R group was significantly higher than that of the D/I-R group (P=0.001). The incidence of ventricular tachycardia, the time history of ventricular fibrillation, and the duration of ventricular tachycardia in the I-R group were also significantly higher than those of the D/I-R group (P=0.013, 0.049, and 0.001, respectively). The reperfusion arrhythmia score in the I-R group [5(3, 6), 57.36] was significantly higher than that of the D/I-R group [3(1, 4), 34.77] (P=0.001). Compared with the I-R group, the D/IR group had significantly smaller MI size [(55.51±1.43)% vs (17.01±1.13)%, P<0.01]. In the I-R group, the expression of mitochondrial ALDH2 was significantly reduced and that of Bcl-2 and Bax increased. Compared with the I-R group, the expression of mitochondrial ALDH2 was not significantly decreased in the D/IR group (P=0.11), while the expression of Bcl-2 and Bax was significantly increased. Compared with the I-R group, the D/I-R group had significantly increased Bcl-2/Bax ratio (0.44 vs 0.22, P=0.001).

Conclusion

Diltiazem reduces MIRI possibly by up-regulating the expression of mitochondrial Bcl-2 and down-regulating the expression of Bax. However, the therapeutic effect of diltiazem is not related with the gene and protein expression of mitochondrial ALDH2.

Key words: Myocardial, reperfusion injury, Diltiazem, Mitochondrial, Aldehyde dehydrogenase 2

表1 目的基因引物序列

基因	引物序列（5′-3′）	引物长度（bp）	退火温度（℃）
ALDH2	上游引物：GTG TTC GGA GAC GTC AAA GA	187	62
ALDH2	下游引物：GCA GAG CTT GGG ACA GGT AA	187	62
Bcl2	上游引物：GACAACATCGCTCTGTGGAT	137	53
Bcl2	下游引物：GACAGCCAGGAGAAATCAAA	137	53
Bax	上游引物：GCGAGTGTCTCAGGCGAAT	144	53
Bax	下游引物：CCCAGTTGAAGTTGCCGTCT	144	53
GAPDH	上游引物：TACCCACGGCAA GTTCAACG	122	62
GAPDH	下游引物：CAC CAG CAT CAC CCC ATT TG	122	62

表1 目的基因引物序列

基因	引物序列（5′-3′）	引物长度（bp）	退火温度（℃）
ALDH2	上游引物：GTG TTC GGA GAC GTC AAA GA	187	62
ALDH2	下游引物：GCA GAG CTT GGG ACA GGT AA	187	62
Bcl2	上游引物：GACAACATCGCTCTGTGGAT	137	53
Bcl2	下游引物：GACAGCCAGGAGAAATCAAA	137	53
Bax	上游引物：GCGAGTGTCTCAGGCGAAT	144	53
Bax	下游引物：CCCAGTTGAAGTTGCCGTCT	144	53
GAPDH	上游引物：TACCCACGGCAA GTTCAACG	122	62
GAPDH	下游引物：CAC CAG CAT CAC CCC ATT TG	122	62

表2 心律失常评分方案

分值	标准
0	<50个室性期前收缩
1	50~499个室性期前收缩
2	>499个室性期前收缩或1阵可恢复性室性心动过速或心室颤动
3	大于1阵可自行恢复性室性心动过速和（或）心室颤动，两者时间相加小于60 s
4	可自行恢复性室性心动过速和（或）心室颤动，两者时间相加60~119 s
5	可自行恢复性室性心动过速和（或）心室颤动，两者时间相加大于119 s
6	不可自行恢复性心室颤动

表2 心律失常评分方案

分值	标准
0	<50个室性期前收缩
1	50~499个室性期前收缩
2	>499个室性期前收缩或1阵可恢复性室性心动过速或心室颤动
3	大于1阵可自行恢复性室性心动过速和（或）心室颤动，两者时间相加小于60 s
4	可自行恢复性室性心动过速和（或）心室颤动，两者时间相加60~119 s
5	可自行恢复性室性心动过速和（或）心室颤动，两者时间相加大于119 s
6	不可自行恢复性心室颤动

表3 各组大鼠再灌注左心室发展压比较（mmHg，±s）

组别	只数	基础状态	缺血15 min	缺血30 min	再灌30 min	再灌45 min
N^组	11	112.75±3.79	108.34±3.96	104.45±3.42	98.83±4.16	95.47±5.78
I-R^组	11	108.76±4.54	57.68±3.23	67.85±5.19^a	75.77±5.33^a	72.34±7.49^a
D/I-R^组	11	113.19±9.75	59.27±6.02	68.66±6.08^a	92.68±5.09^b	90.39±4.29^b

表3 各组大鼠再灌注左心室发展压比较（mmHg，±s）

组别	只数	基础状态	缺血15 min	缺血30 min	再灌30 min	再灌45 min
N^组	11	112.75±3.79	108.34±3.96	104.45±3.42	98.83±4.16	95.47±5.78
I-R^组	11	108.76±4.54	57.68±3.23	67.85±5.19^a	75.77±5.33^a	72.34±7.49^a
D/I-R^组	11	113.19±9.75	59.27±6.02	68.66±6.08^a	92.68±5.09^b	90.39±4.29^b

表4 各组大鼠再灌注30 min以及45 min左心室内压上升/下降最大速率（mmHg，±s）

分组	只数	再灌注30 min		再灌注45 min
分组	只数	＋dp/dtmax	-dp/dtmax	＋dp/dtmax	-dp/dtmax
N组	11	2864.00±237.88	2411.45±188.51	2889.00±256.39	2304.55±164.64
I-R组	11	2063.64±105.57^a	1710.91±217.97^a	2053.64±92.33^a	1544.55±207.72^a
D/I-R组	11	2885.45±286.47^ab	2214.55±104.63^ab	2712.73±236.52^ab	2119.09±84.43^ab

表4 各组大鼠再灌注30 min以及45 min左心室内压上升/下降最大速率（mmHg，±s）

分组	只数	再灌注30 min		再灌注45 min
分组	只数	＋dp/dtmax	-dp/dtmax	＋dp/dtmax	-dp/dtmax
N组	11	2864.00±237.88	2411.45±188.51	2889.00±256.39	2304.55±164.64
I-R组	11	2063.64±105.57^a	1710.91±217.97^a	2053.64±92.33^a	1544.55±207.72^a
D/I-R组	11	2885.45±286.47^ab	2214.55±104.63^ab	2712.73±236.52^ab	2119.09±84.43^ab

表5 各组大鼠再灌注室性心律失常发生率、时程及再灌注心律失常评分比较

分组	只数	室性期前收缩［个，M（Q_R）］	室性心动过速时程［s，M（Q_R）］	室性心动过速发生率（%）	心室颤动时程［s，M（Q_R）］	心室颤动发生率（%）	再灌注心律失常评分［分，M（Q_R）］	平均秩次
N组	11	208（156）	0	0	0	0	1（1）	18.27
I-R组	11	493（140）	72（47）	100	43（73）	63.64	5（2）	57.36
D/I-R组	11	306（57）^a	21（48）^a	54.55^a	0（24）^a	45.45	3（2）	34.77^a

表5 各组大鼠再灌注室性心律失常发生率、时程及再灌注心律失常评分比较

分组	只数	室性期前收缩［个，M（Q_R）］	室性心动过速时程［s，M（Q_R）］	室性心动过速发生率（%）	心室颤动时程［s，M（Q_R）］	心室颤动发生率（%）	再灌注心律失常评分［分，M（Q_R）］	平均秩次
N组	11	208（156）	0	0	0	0	1（1）	18.27
I-R组	11	493（140）	72（47）	100	43（73）	63.64	5（2）	57.36
D/I-R组	11	306（57）^a	21（48）^a	54.55^a	0（24）^a	45.45	3（2）	34.77^a

图1 各组大鼠心脏染色切片

图2 各组大鼠心肌线粒体ALDH2、Bcl-2以及Bax蛋白表达

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