大鼠肾移植急性排斥反应调节性T细胞及其基因表达的机制研究

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2017.12.004

目的

观察肾移植大鼠外周血中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞及其表面标志物Foxp3、ABCC4、eIF6基因表达，结合白细胞介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子-γ（INF-γ）水平及肝、肾功能变化进行相关分析，探讨其在移植免疫排斥机制中的作用及意义。

方法

监测急排组与非急排组大鼠肝、肾功能；ELISA方法检测血浆中IL-2和INF-γ的表达水平；流式细胞仪检测CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺CD25⁺Treg细胞亚群；荧光PCR检测CD4⁺CD25⁺Treg细胞Foxp3、ABCC4及eIF6 mRNA表达。

结果

与术前相比，急排组术后第7天血清肌酐、尿素氮均明显升高（P<0.05）；急排组术后第7天IL-2及IFN-γ均升高，差异有统计学意义（P<0.05）；急排组术后CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与非急排组相比，急排组术后CD4⁺CD25⁺Treg细胞表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与非急排组相比，急排组术后Foxp3+基因表达量明显降低，ABCC4、eIF6基因表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

结论

CD4⁺CD25⁺调节性T细胞在肾移植排斥反应中起到重要作用，CD4⁺CD25⁺Treg细胞Foxp3、ABCC4及eIF6 mRNA参与急性排斥反应的发生，检测其变化可辅助诊断急性排斥反应的发生。

关键词: 肾移植, 急性排斥反应, CD4⁺CD25⁺调节性T细胞, Foxp3 mRNA, ABCC4 mRNA, eIF6 mRNA

Objective

To observe the expression of CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells in peripheral blood (Treg) and their gene expression (Foxp3, ABCC4, and eIF6) in acute rejection (AR) associated with renal transplantation in rats, in order to clarify their role in immune rejection.

Methods

Liver and kidney function was monitored in rats with AR and those with non-acute rejection (n-AR). IL-2 and IFN-γ levels were detected by ELISA. CD4⁺, CD8⁺, and CD4⁺CD25⁺ cells (Treg) in fresh blood were detected by flow cytometry. The expression of Foxp3, ABCC4, and eIF6 was detected by fluorescent PCR.

Results

Compared with preoperative values, serum levels of creatinine and urea nitrogen, plasma levels of IFN-γ and IL-2, and the levels of CD3⁺, CD4⁺, and CD8⁺ cells were significantly increased in the AR group (P<0.05). The percentage of CD4⁺CD25⁺ Treg cells was significantly lower, the expression of Foxp3 was significantly decreased, and the expression of ABCC4 and eIF6 was significantly increased in the AR group compared with the n-AR group (P<0.05).

Conclusion

CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells participate in immune rejection associated with renal transplantation, and detecting the expression of Foxp3, ABCC4, and eIF6 in CD4⁺CD25⁺ Treg cells can assist in the diagnosis of AR.

Key words: Renal transplantion, Graft rejection, CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells, Foxp3, ABCC4, eIF6

表1 PCR扩增引物序列

基因名称	上游引物序列	下游引物序列
Foxp3	CAGCTAAGCCTATGGCTCCTT	AGGGTGCCACCATGACTAGG
ABCC4	AGGCAAGTCGTCCCTGTTG	ATTGCTCCTCACGGTTCCTG
eIF6	GATCTGAGGGGTTTGAGAGGG	TGTTCTCGAACGACGCTCTG
β-Actin	CCCATCTATGAGGGTTACGC	TTTAATGTCACGCACGATTTC

表1 PCR扩增引物序列

基因名称	上游引物序列	下游引物序列
Foxp3	CAGCTAAGCCTATGGCTCCTT	AGGGTGCCACCATGACTAGG
ABCC4	AGGCAAGTCGTCCCTGTTG	ATTGCTCCTCACGGTTCCTG
eIF6	GATCTGAGGGGTTTGAGAGGG	TGTTCTCGAACGACGCTCTG
β-Actin	CCCATCTATGAGGGTTACGC	TTTAATGTCACGCACGATTTC

表2 2组大鼠肝肾功能比较（±s）

组别	只数	时间	AST（U/L）	ALT（U/L）	BUN（ mmol /L）	Cr（ μmol /L）
非急排组	14	术前	107.17±46.41	53.92±21.23	3.95±1.79	59.93±23.53
非急排组	14	术后	105.41+19.85	80.72±33.60^a	4.68±1.57	75.76±13.44^a
急排组	14	术前	86.35±12.47	53.29±18.04	5.01±1.49	41.98±17.55
急排组	14	术后	116.68±20.01^b	71.10±29.05^b	7.29±0.91^bc	119.74±6.80^bc

表2 2组大鼠肝肾功能比较（±s）

组别	只数	时间	AST（U/L）	ALT（U/L）	BUN（ mmol /L）	Cr（ μmol /L）
非急排组	14	术前	107.17±46.41	53.92±21.23	3.95±1.79	59.93±23.53
非急排组	14	术后	105.41+19.85	80.72±33.60^a	4.68±1.57	75.76±13.44^a
急排组	14	术前	86.35±12.47	53.29±18.04	5.01±1.49	41.98±17.55
急排组	14	术后	116.68±20.01^b	71.10±29.05^b	7.29±0.91^bc	119.74±6.80^bc

表3 2组大鼠外周血细胞因子检测比较（±s）

组别	只数	时间	IL-2（ pg /ml）	INF-γ（ pg /ml）
非急排组	14	术前	92.15±14.27	148.21±16.12
非急排组	14	术后	109.77±12.01^a	153.51±14.54
急排组	14	术前	96.22±16.85	138.68±10.77
急排组	14	术后	200.76±30.14^bc	298.80±48.71^bc

表3 2组大鼠外周血细胞因子检测比较（±s）

组别	只数	时间	IL-2（ pg /ml）	INF-γ（ pg /ml）
非急排组	14	术前	92.15±14.27	148.21±16.12
非急排组	14	术后	109.77±12.01^a	153.51±14.54
急排组	14	术前	96.22±16.85	138.68±10.77
急排组	14	术后	200.76±30.14^bc	298.80±48.71^bc

表4 2组大鼠外周T细胞亚群变化比较（±s）

组别	只数	时间	CD3⁺	CD4⁺	CD8⁺	CD4⁺/CD8⁺
非急排组	14	术前	37.01±12.34	18.52±8.88	13.06±4.74	1.63±0.81
非急排组	14	术后	37.32±7.82	26.71±6.98^a	10.95±3.07^a	2.47±0.73^a
急排组	14	术前	38.81±8.42	20.49±5.64	12.10±2.24	1.76±0.64
急排组	14	术后	53.22±8.83^bc	36.07±8.74^bc	18.02±6.10^bc	2.29±1.11

表4 2组大鼠外周T细胞亚群变化比较（±s）

组别	只数	时间	CD3⁺	CD4⁺	CD8⁺	CD4⁺/CD8⁺
非急排组	14	术前	37.01±12.34	18.52±8.88	13.06±4.74	1.63±0.81
非急排组	14	术后	37.32±7.82	26.71±6.98^a	10.95±3.07^a	2.47±0.73^a
急排组	14	术前	38.81±8.42	20.49±5.64	12.10±2.24	1.76±0.64
急排组	14	术后	53.22±8.83^bc	36.07±8.74^bc	18.02±6.10^bc	2.29±1.11

表5 2组大鼠基因相对表达量分析比较（±s）

组别	只数	Foxp3	ABCC4	eIF6
非急排组	14	1.03±0.26	0.21±0.06	0.20±0.10
急排组	14	0.31±0.17^a	1.02±0.23^a	1.03±0.29^a

表5 2组大鼠基因相对表达量分析比较（±s）

组别	只数	Foxp3	ABCC4	eIF6
非急排组	14	1.03±0.26	0.21±0.06	0.20±0.10
急排组	14	0.31±0.17^a	1.02±0.23^a	1.03±0.29^a

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Changes in regulatory T cells and their gene expression in acute rejection associated with renal transplantation in rats

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